logo

新闻中心

线上讲座

《ICE成药靶点探案系列》——记POLQ MMEJ reporter assay 优化历程----TJ

时间:2022-02-11 14:44:28 阅读:229

在ICE做实验,大家的商讨很多,尝试很多,失败很多,挫折很多,重复很多;

经过一阵子的煎熬,突破很多,意外很多,成功很多,收获很多,思考也很多。

我们这里有实习生,有年轻的同事,这次想和大家分享一些科研趣事,也希望给年轻人一些启示和参考——实验不易,切莫轻易放弃。(文末有彩蛋!)

主要的实验目的,是重复上图中的结果1。实验设计的很巧妙,此方法可用于在细胞中评价Polθ(DNA polymerase theta,Polθ, encoded by POLQ)2的活性,相关背景可参考爱思益普的李涛同学撰写的一篇帖子(全面助力新药研发,挑战DDR靶点之POL θ--李涛),在此不做过多介绍。

经过近一个月的努力,ICE也顺利的得到了类似细胞活性数据:

此处想简单描述下MMEJ(microhomologymediatedendjoining)的细胞原理,之前有文章探索过Polθ的修复能力3,对于45nt长度的单链可以完成双链修复,有4个碱基配对(所以称之为microhomologymediated,几个碱基互补即可开始DNA聚合)即可完成修复。当然,这只是DNA众多修复方式中的一个,并非能100%完成修复,这也一定程度上解释了文章的结果errorbar比较大,猜测assaywindow和稳定性都不是很好把控。

为了构造类似的修复方式观察Polθ的修复能力,文中选择了Nanoluciferase作为报告基因,可能利用其灵敏性较高的特点,结合SV40转录终止子和CMV启动子,构建了MMEJ的底物。

根据文中描述,有几个地方,看似容易,我们的团队为此做了很多探索,困惑和惊喜都藏在这里:

选择Nanoluciferase,SV40和CMV的序列相对简单,如何选择两端的单链突出(4条引物)?文章说突出45 nt,如何选择酶切位点?CMV的序列该选择多长?如何引入酶切位点?启动子的基本构造是什么?TATA BOX附近哪些序列不能改?CMV的序列哪些和活性有关?片段的连接是否和质粒连接一样?如何评判连接是否成功?如何判断退火效率?

很多时候,遇到了问题才想到这些。现在有些后悔当时上学没有好好的听课、做笔记,这个时候需要的就是基础的分子生物学(酶切+连接)。

原理很清楚:变性-退火-连接-OK。

实际确是:变性-退火-连接-(循环n次) -变性-退火-连接-OK-变性-退火-连接-OK

实验遇到问题,需要去解决,需要重复确认,要以科学的思维为导向,这一步做错,会影响后面一连串的实验。所以在ICE,我们提倡要以做原子弹的思维做好团队间地配合。

Run 1:摸索4条引物和底物的连接比例,初步尝试,貌似看到连接产物,可是其余条带是什么?

接下来就是重复,改变些条件,继续看看:

结果都看到类似的双条带,看来这个结果在目前的条件下,是符合一定的原理,是真实存在的。这里就引发了新的讨论:

出现的条带,貌似是连接产物大小的两倍,难道是连接产物,自连了?可是根据下面的示意图所示,自连是如何发生的呢?难道T4 ligase除了连接的作用,还有聚合的作用?难道有和Polθ类似的功能?内心觉得,这个不是很好解释,不可能。

T4 DNA Ligase

· Catalyzes the formation of a phosphodiester bond between juxtaposed 5' phosphate and 3' hydroxyl termini in duplex DNA or RNA.

简单搜索一下,并未看到T4 ligase有聚合修复的作用。于是我们安排了测序,看看上面的条带是什么。当然,第一次失败了,测序没有测出结果。

Run 2:重头开始,QC每一个步骤。确保退火成功

电泳检测了之前的退火片段,看似还可以,问题不大。后来ICE根据自身的DNA退火HTRF和TR-FRET的实验经验,优化了退火的buffer,也改变了退火降温条件,逐一尝试,终于获得了更干净,更纯的退火底物,到此,引物退火成功。

这个结果,主要是元旦假期间出来的。

Run 3:优化连接,尝试不同的dsDNA浓度,貌似看到增大的条带,不过还是有两条带。暂时先不纠结这个问题,继续向前走。

Run 4:陆续提取质粒,酶切,连接不同批次。

电泳结果所示,让人大失所望:怎么连接的条带不如未连接的大?到底发生了什么?哪里出了错误?

继续尝试,继续验证,all negative!结果让人不解,让人头疼,况且,这个时候即将过年,同事们陆续启程,回家。我们不希望带着这些负面的结果度过新年。大家仔细回忆实验的细节,到底问题在哪。又是一次次的尝试。

这个时候,做了八年多ADME的丽丽同学和大家说:之前跑过一次条带,上样量,引物的浓度,电泳时间,都会影响这个图。而这几次的对照都是酶切产物,不是连接产物的对照组(此处是指no T4 ligase,但是有引物),会不会有影响?

结果我们试了一次,比较了含有引物和不含有引物试dsDNA的电泳情况。

果然!被她说中了!

但是我还是怀疑,这个不太合理,不过也有可能。如果电泳时间足够长,是不是右侧的两个条带,会跑到一条线上?不管怎样,保证背景条件类似的情况下,之前清晰的结果,还是可以重复的。可以说,到这里,我们有把握再得到准确的连接产物。

为了验证,又一次重新引物退火做起,连接,电泳,在除夕的前夜,接近午夜,电泳了45min,我们拿到了如下的结果:

一切疑惑,问题,都在这张电泳图面前解开了。

我们对视一笑,收拾东西,准备回家。外面已经开始下起了雪。瑞雪,虎年好兆头!

我把这张图发给了公司的BD团队,作为新年礼物。到了这里,我们解决了MMEJ底物的制备问题。看了看电泳图的日期,前后的工作日,我们花了三周时间提取质粒,酶切回收,五天的时间解决了MMEJ底物的制备过程。

不过又有了新的问题:如何获得大批量的底物?质粒的提取,酶切和回收,连接和回收,到了最后,能获得的连接底物已经不是很多。一般大提质粒我们需要100 mL菌液就可以用到毕业,这次我们提取了5L菌液,感觉还是不够。无奈,我们流水线式操作,才获得200 ug连接产物。

不过,这终究是技术问题,工艺问题,其实没有开始摸索时那么难了。如今我们已经找到方式获得mg级别的MMEJ连接产物,期待后续更多的优化结果。POLQ的靶点,很有意思,有很多工作可以尝试,ICE也希望为广大的科研工作者,药物研发的团队提供技术支持,一同开拓这片新的领域,加速大家研发的进程!

考虑到瞬转实验的繁琐过程,我们也考虑构建稳转的细胞系,如另一篇文献所描述,见下图4,方法还是有的,只是这里的assay window也不是很大,难度会不小。我们也在尝试其他新的底物设计,希望能实时的看到POLQ的修复过程和发生位置,期待新的探索,新的结果,届时再与大家分享。

围绕POLQ,ICE的团队内部仍然在开发其他酶学方法,去解决选择性的问题;也在开拓细胞学的方法,验证特异性的问题;也在筛选其他cell types,试试有效性的问题,看看哪些细胞对POLQ的抑制更敏感。

太多工作需要做,后续将围绕这个靶点收集成药性的数据,大力支持创新药物的研发。

后记(彩蛋部分)

与其说解释这个意外结果,还不如说对做出这个结果的同事表达一次歉意!当时我心急,误会了大家!

当我初次看到这个结果的时候,我说什么也不相信这个结果是按照之前摸索过的条件做的。而且怎么也不相信这个是对的,一定是哪里做错了。当时没有多想,重复了一次实验,这个现象消失了。

后来我们细聊才发现,这一组其实丽丽同学忘记加入了引物。

那就一切清晰明了,自连,并不是连接产物的自连,而是酶切产物的自连。所以再次连接时,我们增加了引物的浓度,减少酶切产物的自连,最终获得了相对纯度较高的连接产物。

在此感谢在这个实验中贡献的各位小同事们,大家的经历和付出是值得的!有过拖沓、有过厌倦、有过打击、有过反复,只有经历过这些场景的同事,才能体会美好结果的美好!后续的科研路程中,如此场景便是家常便饭,just enjoy and have fun! 多和自己说几次就好了。

在ICE实习的同学和工作的朋友,我们不要求大家有多么多的技术和知识的积累,半年,一年,不会有什么明显的收获。但是希望各位能在ICE体会到一种永不放弃的精神,不要轻言放弃,不畏惧困难,在日后的工作生涯中,继续为中国创新事业贡献力量。

ICE有着不放弃的信念:爱求索、思新异、益中国、普创新。

如何去实现,是我们现在的工作;有着大方向的指引,为科技工作者服务的理念,做事就会有动力,也会有意义。

希望看到此文的年轻同学和朋友,科研路上勇攀高峰,为中国可持续科技创新储备有生力量!

Reference:

1 Zatreanu, D. et al. Poltheta inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun 12, 3636, doi:10.1038/s41467-021-23463-8 (2021).

2Seki, M., Marini, F. & Wood, R. D. POLQ (Pol theta), a DNA polymerase and DNA-dependent ATPase in human cells. Nucleic acids research 31, 6117-6126, doi:10.1093/nar/gkg814 (2003).

3 Wyatt, D. W. et al. Essential Roles for Polymerase theta-Mediated End Joining in the Repair of Chromosome Breaks. Molecular cell 63, 662-673, doi:10.1016/j.molcel.2016.06.020 (2016).

4 Wang, Z. et al. DNA polymerase theta (POLQ) is important for repair of DNA double-strand breaks caused by fork collapse. J Biol Chem 294, 3909-3919, doi:10.1074/jbc.RA118.005188 (2019).


加载中