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《普创新》全面助力新药研发,挑战DDR靶点之WEE1

时间:2022-04-24 08:50:59 阅读:125

细胞周期是在细胞分裂过程中被高度调控的过程,包括复制前期(G1期),DNA复制期(S期),合成后期(G2期)和分裂期(M期)。在细胞周期中有几个关键性的关卡(checkpoint)包括G1-S检验点,S期和G2-M检验点,这些检验点存在的意义是保持基因组的完整性并使受损伤的DNA在进入有丝分裂之前得到修复。周期素依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases, CDKs)通过使特异底物磷酸化调节细胞周期,其活性依赖于与周期素Cyclin结合形成复合物,并且其活性还受到磷酸化调控,CDK1的磷酸化状态进一步控制G2-M检验点。Wee1是细胞周期G2-M检验点的“守门员”,允许细胞在进入有丝分裂之前进行DNA损伤修复。Wee1通过磷酸化CDK1 Tyr15,使CDK1维持在非活性状态,从而抑制CDK1-cyclin B复合体的活性,使细胞分裂停滞在G2-M检验点,负调控细胞周期,其生物学意义是使未来得及修复的DNA损伤被修复,防止细胞携带DNA损伤就进入有丝分裂期。另外,Wee1在S期还发挥重要调控作用,一方面Wee1在DNA复制完成之前抑制CDK1 Tyr15,阻止细胞由S期进入G2期;另一方面,在S后期Wee1磷酸化组蛋白H2B Try37位点,并抑制多个组蛋白基因转录。在S期和G2期,Wee1表达量增加,活性增强,有利于DNA的修复;进入分裂期后,Wee1活性降低,使细胞顺利完成分裂。


细胞内DNA面临紫外照射或物理化学等外界因素时容易被破坏,即便生理条件下也会出现受损。正常细胞会在细胞周期的G1期进行受损DNA的修复,但是癌细胞通常缺乏G1-S检验点,不能检测出受损DNA从而导致其DNA损伤积累的风险,这对于癌细胞的增殖是有害的。这时癌细胞则会依赖G2-M检验点进行DNA修复并避免携带DNA损伤的细胞过早进入有丝分裂期,防止有丝分裂灾难的发生,在这一过程中Wee家族蛋白激酶发挥重要作用。

Wee家族蛋白激酶有3个成员,分别为Wee1 (Wee1A), Wee2 (Wee1B)和Myt1 (PKMYT1)。Wee1在体细胞中普遍表达,通过磷酸化CDK1(Cyclin-dependent Kinase 1)从而抑制CDK1-cyclin B复合体,起到负调控细胞周期的作用。Wee2只在生殖细胞中特异性表达,通过磷酸化CDK1的Try15来抑制减数分裂,因此被认为是潜在的非激素类避孕靶点。Myt1在体细胞和胚胎细胞中都表达,定位于内质网-高尔基复合体中,在哺乳动物体细胞中,Myt1抑制CDK1-cyclin B1和CDK1-cyclin B2,对有丝分裂结束时的高尔基体和内质网的组装至关重要。在果蝇中双缺失Wee1和MYT1会导致合成致死。三种Wee激酶在催化活性和磷酸化状态方面存在显著差异,在Wee蛋白激酶的研究中,Wee1成为更有潜力的药物靶点。

Wee1结构及功能

Wee1蛋白属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族,由Wee1基因编码产生,最早在裂殖酵母细胞中被分离出来。人源Wee1编码646个氨基酸,分子量大小为71597 Da。Wee1全长蛋白包含三个结构域: N末端结构域,C末端结构域和中间的催化结构域。N端序列具有glycine-rich loop (306-311),C端包含催化序列(422-433)和激活序列(462-486)。在这些序列中Wee1缺乏经典的HRD, DFG和APE motifs,取而代之的是HMD (424-426),DLG (463-465)和ANE(484-486) motif,这为Wee1选择性抑制剂的开发提供了新的可能性。区别于Wee2和Myt1的是,Wee1的N端包含了3个另外的PEST序列(24-126),此外,Wee1中潜在的蛋白水解切割位点可以严格控制其细胞内半衰期。


Wee1结构示意图

ZN-c3结构及作用位点AZD1775结构示意图


Wee1在调控细胞周期中的作用示意图

Wee1发挥调节细胞周期的功能是受到上下游信号通路调控的。在G2-M检验点,当DNA受损时,ATR信号通路被激活,ATR通过磷酸化CHK1的Ser317和Ser345使其被激活,激活的CHK1反过来磷酸化Wee1并抑制CDC25活性,Wee1接下来使CDK1的Tyr15发生磷酸化,抑制CDK1-Cyclin B复合体的活性,使细胞周期停滞在G2-M期并使细胞完成DNA修复。当DNA损伤修复完成后,Wee1活性减弱,CDK1的磷酸化水平降低,同时CHK1对CDC25的抑制性降低,促使细胞进入有丝分裂期从而顺利完成细胞周期。在没有DNA损伤的情况下,polo样激酶 1 (PLK1) 磷酸化Wee1,此时Wee1可以被泛素连接酶识别并降解。PLK1还可以磷酸化和激活CDC25,使细胞可以顺利进入有丝分裂期。


Wee1在DNA损伤修复信号通路中的机理

癌症的特征是由于上游信号通路突变和DNA损伤修复通路缺陷导致细胞周期异常,癌细胞不受控制地快速增殖,癌细胞缺乏G1-S检验点,依赖G2-M检验点来防止过度的DNA损伤。Wee1在调控G2-M检验点起重要作用,在各种癌症类型中呈现高水平表达,包括乳腺癌、白血病、黑色素瘤、成人和小儿脑肿瘤。如果针对Wee1进行抑制进而损害细胞周期中G2-M检查点,使携带DNA损伤的细胞进入有丝分裂从而导致DNA损伤积累和细胞死亡,对于癌症细胞的生长抑制具有重要意义,因此开发Wee1抑制剂成为治疗癌症的一个方向。

Wee1抑制剂的开现状

Wee1是新一代DNA损伤修复(DNA damage repair, DDR)靶向疗法的重要靶点,在抗肿瘤药物研发中具有良好的前景,目前已有多款针对Wee1的抑制剂药物研发,已有多种小分子抑制剂进入临床研发阶段,Zentails公司开发的ZN-c3以及默沙东公司开发的AZD1775抑制剂已经进入临床2期。ZN-c3是一款潜在“first-in-class”的Wee1口服抑制剂,美国FDA已授予口服ZN-c3快速通道资格,用于治疗复发或持久性子宫浆液性癌。ZN-c3在临床试验中作为单药治疗多种实体瘤,已经表现出可喜的抗癌活性,在结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和子宫浆液性癌患者中都观察到了部分缓解。AZD1775作为首个被报道的Wee1抑制剂,一直被寄予厚望,二期临床数据显示在治疗卵巢癌和浆液性子宫内膜癌方面均取得了显著疗效。



IMP-7068,SY-4835,Debio-0123分别由上海瑛派药业有限公司、首药控股(北京)有限公司和Debiopharm公司开发,均处于临床1期研发状态。Schrödinger公司在研的Wee1抑制剂STC-8213处于临床前研发状态,该公司的研究称其筛选的先导化合物具有高度的激酶选择性,且没有显示对细胞色素P450 3A4酶(CYP3A4)产生时间依赖抑制作用,在相关的CDX模型中表现出有利的ADME / DMPK属性和强抗肿瘤活性。

结束语

爱思益普专注于基于靶点的先导化合物筛选和优化,批量构建了新药筛选的靶点和筛选技术,致力于以高效、专业的服务,帮助新药研发企业快速有效地推进新药研发项目。在Wee激酶家族中,我们构建了三种酶的ADP-Glo方法用于筛选Wee1,Wee2和Myt1抑制剂。在ADP-Glo反应体系中加入激酶、底物和ATP进行反应,激酶在磷酸化底物的过程中由ATP提供高能磷酸基团产生ADP,ADP-Glo试剂盒能够将生成ADP的量转化为Luminescence光信号,通过检测光信号间接反映激酶活性,实验原理见下图。


ADP-Glo方法原理图

我们的测定结果显示,Wee1阳性药AZD1775的IC50数据结果稳定在1 nM;Wee2目前还没有商业化的特异性抑制剂,我们使用了激酶通用型抑制剂Staurosporine,测得的IC50为1.38 μM;测定PD0166285对Myt1的抑制作用,IC50为6 nM,上述实验结果均稳定可重复,适用于快速、通量的小分子抑制剂筛选。




数据来源:爱思益普

爱思益普目前拥有强大的Drug Discovery Bioscience技术团队支持药物活性评价的一体化研究,如细胞学层次上评价Wee1抑制引起的细胞周期变化、DNA损伤、CDK1、CDK2活化水平、细胞凋亡、cell panel筛选药物敏感细胞系等等维度的评价;结合PK-ADME的平台,可以评价药物对CYP3A4抑制,及成药性方面的优化;ICE的hERG筛选、KinomeOneTM310 –kinase panel、SafetyOneTM 47/90 - Safety panel以及CardiacOneTM - Cardiac safety panel更能在选择性上和安全性上给予更多数据支持和研究。爱思益普专注创新领域,愿意与合作伙伴一同加速中国创新药物研发进程。


CYP3A4 LM stability assay optimization at ICE


Total or phosphorylated protein quantification byImmunofluorescence assay (IFA) at ICE

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