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全面助力新药研发,挑战DDR靶点之WRN

时间:2022-05-11 13:16:05 阅读:49

背景介绍

解旋酶是一类能解开核苷酸双链的酶,1976年在大肠杆菌(Esherichia Coli. E.coli.)中发现。解旋酶广泛存在于多种生物体中,尽管种类繁多,人们在研究过程中发现,这类蛋白酶在其氨基酸序列上有一定的同源性和相似性。分析表明,这些同源序列在进化过程中构成了几个高度保守的区域,这些区域执行不同的酶功能在细胞内它们参与DNA复制、修复、转录重组以及RNA接拼、核糖体组装、蛋白质翻译,端粒稳定。最近,发现个别解旋酶参与机体天然免疫反应机制。

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解旋酶超家族

解旋酶SF2中的RecQ解旋酶亚家族在核酸代谢过程中起了关键的作用,这一家族参与DNA复制、DNA修复、重组、转录甚至端粒稳定。人们发现在人体中存在RECQ1BLMWRNRECQ4RECQ5五种RecQ解旋酶。其中,BLMWRNRECQ4编码基因缺陷会导致人类相应的疾病发生,它们分别为Bloom综合症(BS)Werner综合症(WS)Rothmund-Thomson综合症(RTS)RAPADIINO综合症和Baller-Gerold综合症。这些疾病在人类中都是极其罕见的隐形遗传疾病,在分子水平都表现为基因组高度不稳定性、染色体异常(染色体断裂缺失、重排、姐妹染色体交换等)和对DNA损伤因子敏感性增加。在临床上表现为过早衰老、型糖尿病、骨质疏松、动脉硬化和极度容易发癌症。这一临床现象引起了人们的关注和研究。对解旋酶的结构功能、作用机制的研究不仅可以认清核酸代谢过程,还能帮助我们揭示癌症发病的某些机理。同时了解病毒解旋酶的结构与功能,为抗病毒药物的研制提供了新的研究思路。

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RECQ家族结构

大部分RecQ解螺旋酶家族成员均具有一个解螺旋酶结构域,能结合并水解ATP,此外,还含有一个高度保守的多功能RecQ碳末端(RecQ C-terminal region, RQC)结构域和一个解螺旋酶RNAD碳末端(helicase RNase DC-terminal, HRDC)结构域。RQC结构域可使RecQDNA结合并介导DNA代谢的蛋白质的相互作用; HRDC结构域可促进并稳定RecQDNA的结合,但不具有催化活性。另外,某些RecQ家族成员还含有锌指基序,此锌指基序在维持RecQ蛋白的稳定性以及促进其与DNA结合等方面发挥重要的作用。同时DNA和蛋白质结合结构域( DNA and protein-binding domainDPBD)可作为WRN的调控结构域,从而调控其活性,并通过蛋白质-蛋白质的相互作用促进WRN的直接细胞定位。

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RecQ家族分类

WRN 结构及功能

WRN1432个氨基酸组成、分子质量为160KD在未受损的人类细胞中,WRN 主要定位于核仁,但在 DNA 损伤后,它会迅速移动到其他核区域S期细胞的免疫化学染色示了 WRN 点状泛核分布,表明WRN可能与DNA复制有关。WRN是人类RecQ解旋酶家族中唯一拥有3 → 5核酸外切酶活性的成员,其N末端核酸外切酶区域,有利于WRN处理复杂的核酸结构中间解旋结构域,能结合并水解ATP,从而供能解开双链DNA。外切酶和解旋酶区域之间有个具有转录活性的酸性区域。紧接着解旋酶区域,有个高度保守的RQC结构域,在稳定结构及识别结合DNA方面发挥作用。CHRDC结构域,可调节催化与DNA结合的活性。

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WRN结构示意图

WRN 除了具有解旋酶和外切核酸酶活性,还与BER途径中的许多蛋白相互作用,包括 POLBPOLD、增殖细胞核抗原 (PCNA)、复制蛋白 A (RPA)结构特异性内切核酸酶 1 (FEN-1) 和聚 (ADP-核糖) 聚合酶 1 ( PARP-1)WRN 有利于 POLD 合成发夹结构和三核苷酸重复序列四链体结构,这对于DNA损伤修复有重要作用。

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WRNBER通路中的作用机理

WRN抑制剂

Kulikowicz T等测试鉴定了四种化合物对 WRN 活性的影响, 结果显示四种化合物 WRN 解旋酶活性的活性有不同程度的抑制,但是都不能在相同浓度范围内抑制 WRN 外切核酸酶活性 

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目前已经出现的商品化抑制剂NSC 617145,是一种 WRN 解旋酶抑制剂 (IC50 = 230 nM),以浓度依赖性方式抑制WRN解旋酶的ATP 酶活性,但不抑制外切核酸酶活性,它对 WRN 的选择性优于 BLMFANCJChlR1RecQ UvrD解旋酶,在5 uM 浓度下仅表现出 7% RECQ1抑制。NSC 617145 通过形成 DNA 双链断裂 (DSB) 和以WRN解旋酶依赖性方式诱导细胞凋亡来抑制 HeLa 细胞的生长。NSC 617145 还与丝裂霉素 C 协同作用以抑制Fanconia 贫血缺陷细胞的生长以及诱导 DSB 和染色体异常。

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结束语

爱思益普专注于基于靶点的先导化合物筛选和优化,批量构建了新药筛选的靶点和筛选技术,致力于以高效、专业的服务,帮助新药研发企业快速有效地推进新药研发项目。在WRN项目中我们构建了unwindingADP-Glo方法用于筛选WRN抑制剂。同时爱思益普可提供相关蛋白产品。

1. WRN unwinding方法筛选

在此方法中我们合成两条DNA单链,分别标记一个荧光基团和淬灭基团,两条单链通过退火得到dsDNAWRN通过识别特定的序列位点,使dsDNA解旋暴露出荧光基团,产生荧光。

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WRN unwinding 实验原理


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数据来源:爱思益普


2. WRN ADP-Glo方法筛选

WRN是一种依赖于ATP的解旋酶,在解旋过程中消耗ATP,生成ADP

因此我们可使用ADP-Glo方法,通过检测产物ADP的量来判断化合物对WRN的抑制作用。。

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ATP-Glo 实验原理


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数据来源:爱思益普

3. 细胞学方法筛选

在酶学方法评价的同时,爱思益普可以同时进行细胞学评价,利用Operetta高内涵的平台分析DNA损伤Marker γH2AX的水平看DNA的损伤,也可以通过细胞凋亡(FACS)、增殖等手段评价化合物在MSSMSI细胞系中的活性。

 

参考文献:

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