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匠者论道:心肌细胞分离那点事儿

时间:2022-05-23 14:52:27 阅读:106

背景介绍

  心血管疾病被认为是现今最严重的慢性非传染性疾病,心脏病是其中重要的表现形式,相关的医学研究也成为当前研究的热点。尽管目前用于治疗心脏疾病的药物相对较多,但多数因为其药效欠佳、不良反应严重等因素存在一定的局限性,因此基于疾病发病机制开展的相关研究,最终实验对因治疗成为重点关注的研究方向,其中动物和细胞疾病模型在这一研究中发挥的作用无可替代。

  心脏疾病在细胞水平的研究因心肌细胞的不可再生的特性,无法进行长期的培养和传代,因此大多数来源于原代心肌细胞的急性分离,因此高质量的心肌细胞分离对于在细胞和分子水平上成功研究心脏疾病的发生发展至关重要。本文就心肌细胞的急性分离(以Langendorff离体灌流联合酶解法为例)进行一个简单的概述和经验分享。


影响心肌细胞质量的主要因素

1.平衡盐溶液

  用于心肌细胞分离的平衡盐溶液起源于1882年,Sydney Ringer发现,自来水配制的生理盐水与蒸馏水配制的生理盐水相比,前者可以维持离体心脏的收缩,因为自来水中含有各种微量的无机物。他首次揭示了细胞外离子浓度对心脏生理功能的重要性,开发了一种基于血液成分的盐溶液来保持离体蛙心的跳动,证明了对心脏收缩的收缩是由钙离子和钾离子共同调节的,碳酸氢钠虽不直接参与心脏的收缩调节,但它可以中和心肌收缩时所产生的酸,防止酸中毒,因此起着非常重要的间接作用。随着研究的不断深入,Locke在此基础上增加了葡萄糖(5.6mmol/L),并阐明了氧气对于离体心脏的重要性。Tyrode加入了磷酸氢盐及镁离子,并大大提高了碳酸氢盐的浓度,使其更加适应哺乳动物的心脏体外研究。目前常用的细胞分离液体大都是在Tyrode的基础上进行微调整,比如增加HEPES或MOPS(丙磺酸)用于维持恒定的pH,使平衡盐溶液的pH更接近正常的血液pH值。


2.钙离子及与钙离子相关的影响因素

  钙离子:分离心肌细胞过程中无钙缓冲液的灌注是必不可少的一步,然而Zimmerman和 Hulsmann发现,心脏离体后缓冲液中Ca2+从无到有的转换过程会导致部分心脏组织破裂,钙离子内流,使细胞出现明显的挛缩和细胞内酶的大量释放,组织高能磷酸盐耗尽,以及包括肌丝挛缩和线粒体肿胀在内的超微结构损伤。引起这种损伤的机制可能是Ca2+从无到有的灌注期间细胞之间的部分解耦联,心肌细胞收缩力集中在残余粘附区域,导致肌膜穿孔,从而大量Ca2+内流和肌细胞膜损伤,这种Ca2+从无到有的过度带来的这种现象称为Ca2+ paradox。Alto等证实大鼠心脏在无Ca2+缓冲液中收缩活动被抑制超过5min,心肌的收缩功能将很难恢复,因此在心脏离体后转移过程中可以在低温的同时,缩短心脏在无钙缓冲液中的时长,从而在一定程度上削弱Ca2+ paradox所带来的损伤,提高心肌细胞对Ca2+的耐受能力。

  牛磺酸(Taurine):牛磺酸(氨基乙烷磺酸)是一种普遍存在的化合物,它在大多数哺乳动物组织中浓度很高,但在心脏和骨骼肌中的浓度尤其高,是许多哺乳动物所必须的营养物质。在Ca2+ paradox发生时,心脏组织中Taurine的含量会下降,进而导致心肌收缩能力下降,而Taurine缺乏导致的心肌病是可逆的。因此在细胞分离过程中,无钙缓冲液中添加适量的Taurine(10 mM/L)即可通过影响肌浆网Ca2+ ATP酶的活性缓解Ca2+ paradox发生对细胞造成的损伤。此外,心肌细胞中Taurine的摄取和释放有助于细胞渗透压的调节,使保持正常的形态。

  BDM(2.3-丁二酮单肟):BDM在心肌细胞分离时常被用于抑制细胞的收缩。由于细胞在发生Ca2+ paradox时,会有大量的Ca2+内流,导致细胞的强烈收缩。而BDM可以通过抑制肌球蛋白Ⅱ的ATP酶活性来解除兴奋-收缩耦联,达到保护心肌细胞的目的。但BDM却是一把双刃剑,BDM最初是为了对抗乙酰胆碱酯酶引起的有机磷中毒而开发的,因此可能影响心肌细胞的动作电位,故在心肌细胞的分离过程中BDM的加入需根据实验目的来判断。

  温度:心脏离体后置于4℃低温环境减少其代谢,有助于降低心肌细胞耗氧量。因此心脏离体后可在低温条件下进行转移和初步清洗。4℃还可以降低Ca2+paradox的损伤,但酶的最适活性温度为37℃,限制了其使用低温进行细胞分离的过程,因此大多数实验室仍使用35~37℃条件下进行细胞的分离。


3.牛血清白蛋白(BSA)

  心肌细胞分离时,常常有操作人员在缓冲液中加入牛血清白蛋白(0.1~7%),其作用是维持胶体渗透压,从而防止水肿,并减少实验中蛋白质和毒素的非特异性结合,但是BSA的浓度过高也会抑制消化酶的活性,在细胞保存重运用较为广泛。


4.酶及心脏离体前的状态

  消化酶是心肌组织解离成单细胞的决定性因素。细胞外基质(ECM)是够成细胞的骨架,其主要成分为胶原和弹性蛋白。因此胶原酶是消化心脏组织的首选消化酶,往往还需要配合胰蛋白酶或弹性蛋白酶共同完成消化细胞的任务。值得注意的是,心衰或房颤等疾病会导致ECM的重构,其中胶原的丰度、类型和结构可以改变,因此某些模式动物(如心肌缺血、心衰、房颤模型等)的心脏状态较正常动物有很大变化,在进行细胞的分离时也需要适应特定的疾病状态,选择酶的用量及消化时间。


结束语

  高质量的心肌细胞是心脏疾病药物研发及心脏电生理研究工作的重要工具,爱思益普在小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬及乳鼠原代心肌细胞分离及电生理检测方面具有丰富的经验,搭建了成熟的技术平台,希望能成为您新药研发或科研路上的助力者。


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