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《益中国》连接中国学术与产业——ICE蛋白降解平台服务开启!暨十二周年献礼!

时间:2022-06-29 14:18:41 阅读:144

近日看到清华大学饶燏教授团队又发表一篇PROTACs在学术界和工业界的进展综述,很振奋人心1,文中罗列了非常多的可降解靶点。之前饶教授的实验室对PROTAC分子就有过系统的汇总2,短短两年多的时间,该领域又有了很多突破,可见进展之快。PROTAC分子的独特性,深深吸引了许多科学家,该分子的研发紧密地连接了药化、化学和生物研发团队。PROTAC分子,不按常理设计,不按常理优化,不按常理检测,也不按常理合成,也不能按常规分子一样分析,特别受到科研届和工业界的钟爱。PROTAC分子的特殊性,一边为这类分子的研发和优化带来新的挑战,也为新型化合物的设计带来很多可能。过去的二十多年里,PROTAC分子也有多个走向了临床3,还有很多仍处在研发阶段,众多实验室参与其中,从PROTAC领域文章发表的数量及增长趋势上,也能看到投入其中的科研团队及产业化力量有多少。


艰难和挑战巨大,但这正是吸引ICE团队的一个主要因素!我们希望在中国看到更多的PROTAC分子进入临床试验,这里需要多方位平台的融合与合作!
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简而言之,PROTAC(Proteolysis-Targeting Chimera),称作蛋白水解靶向嵌合体,是一类分子,通常含有三部分:一段与靶蛋白结合,一段与泛素连接酶(E3)结合,中间靠linker相连。此类化合物在细胞中能使靶点蛋白和E3靠近。合适的酶(E3)遇到合适的底物(蛋白表面的赖氨酸),就有可能发生反应(将靶蛋白泛素化),标记上泛素链的蛋白,在细胞体内有一部分可经泛素-蛋白酶体通路降解。此类过程首次在2001年Sakamoto3团队报道,后经多年努力,已经有很多分子走向临床I期,并且有相当多的工作正围绕难成药靶点推进。

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ICE团队积极布局PROTAC分子的评价和筛选,在蛋白表达、二元复合物结合、三元复合物形成、蛋白降解、细胞增殖抑制、细胞信号通路调节的评价、HiBiT敲入细胞系的构建等方法开发中有丰富的经验积累。4 PROTAC需要结合到靶点并发挥介导降解的作用,需要经过细胞膜进入细胞,需要结合到靶点,同时需要结合E3形成三元复合物,并在空间上符合E3介导的泛素化过程。此处我们需要考虑几个关键的步骤:PROTAC分子的稳定性,透膜性、与靶点的亲和力、与E3的亲和力、三元复合物形成的能力、靶点细胞中的E3表达水平及和靶点相互匹配的E3种类、泛素化过程、蛋白降解的动力学、信号通路的变化、细胞表型的变化、脱靶的效应、细胞毒性等等环节。


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PROTAC分子的细胞之旅5

ICE团队长期从事PROTAC分子活性的筛选和评价,针对PROTAC的特性和发挥作用的环节,ICE也在积极布局对应的研发能力,专注于难成药靶点的药物研发,如:

蛋白水平开展蛋白表达和纯化、生物物理学评价,蛋白亲和力、三元复合物的形成等。这里会用到SPR、MST、TSA、DSF等技术,也会帮助客户开发蛋白与蛋白互作依赖的三元复合物形成实验;

细胞水平可优化蛋白的降解与表达水平的检测,比如传统WB、数字化WB、通量化ICW和IFA等技术,也可以利用商品化试剂盒如AlphaLISA,ELISA, HTRF等方法检测总蛋白的表达水平;同时结合细胞信号转导通路的检测、细胞活力与增殖等层次,多方位确定PROTAC分子在细胞中的活性。

机制研究上可以通过ADME的方法、蛋白组学、结构生物学等手段,评价PROTAC分子在细胞内发挥作用的机制,也可以通过抑制剂的手段研究蛋白降解通路的特异性等等图片.png

ICE布局PROTAC分子的研发能力


关于BTK的PROTAC研制进展很快,在研的项目较多,机理相对清晰,也有对应点突变引起的耐药机制,此处正是PROTAC分子发挥作用的空间,适合早期验证PROTAC分子的设计原理。关于BTK的体外实验和体内实验相对完善,以此为例,简要地描述ICE在PROTAC分子早期研发布局的常用分析方法,简介如下:

在蛋白水平,理论上也可用SPR, MST, TSA, DSF及REFEYN等技术评价蛋白亲和力、三元复合物的形成。酶学活性的抑制,也可优化BTK binder的亲和力。还有一种我们生化团队的同事非常喜欢的办法,就是与合作方的药化和化学团队一同设计tracer或probe,做竞争性的结合实验。一种使得荧光基团与BTK的binder相连,一种与E3的binder相连,此处tracer,也可随着分子的亲和力强弱做后续调整。同时在早期确定活性分子后,及时收集晶体结构数据,分析binder与靶点的结合细节。

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BTK酶活性测试(ICE数据)

细胞水平的降解可在Ramos或OCI-LY10细胞中进行,根据目前的经验,在优化方法的早期,会利用传统Western Blot实验看趋势,再结合数字化Western Blot(主要使用ProteinSimple的JESS设备)确定降解情况,用于后续筛选。在抗体浓度优化和蛋白上样量两个角度摸索线性关系,确保后续的定量分析准确可靠。

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传统电泳Western Blot实验(ICE数据)

相比传统电泳Western Blot实验而言,JESS则显得更为便捷,制备样本流程简单。Jess平台是一款完全自动化传统Western Blotting的系统,仅在3小时内即能提供高达24个样本的数据。通过免疫分析或总蛋白分析2-440 kDa分子量范围的蛋白质表达。可获得准确的定量结果和相当高的数据重现性,并且样本量消耗极低。Jess系统与传统Western Blot检测之间的最大区别是Jess仪器是一款基于毛细管的无传统凝胶、无斑点和免手动的免疫分析平台,可集成并自动化整个蛋白质分离和检测过程。每天可保证两到三轮实验,保证了实验的时效性、稳定性和可重复性。产生的信号可直接量化处理,也保证了实验的灵敏度。

如下图所示,JESS的量化关系清晰,其线性关系也可直接由仪器计算并导出。选好条件,即可直接用于后续蛋白表达水平的检测。目前ICE团队已用JESS顺利完成多项蛋白降解相关实验。

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数字化Western Blot-JESS实验(ICE数据)

待初步测试条件摸索完毕,下一步将会测试化合物的DC50和Dmax,此处JESS得到的结果如下,可以清晰地看到PROTAC分子对靶点的降解作用。该流程易于上手,确定好样本的处理条件之后,结果相对稳定,可比较不同批次实验数据间的相对活性。

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数字化Western Blot-JESS实验(ICE数据)

对于JESS而言,还有一个优势我也是刚刚发现,就是厂家已有的验证数据。根据之前的经验,只要抗体和样本的制备流程一致,JESS实验可重复的概率较大,利于快速推进蛋白含量检测。结合饶教授综述文章中提到的一些靶点和浙江大学PROTAC数据库中的信息(靶点列表见文后附录),我也简单搜索了一下,大部分靶点还是有验证数据的,这大大地减少了我们很多方法摸索的过程。



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数字化Western Blot-JESS实验(ProteinSimple官网数据)

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对于大量的PROTAC分子细胞活性筛选,也有适合于微孔板的方式,如可开发方法的In-cell western(ICW)和Immunofluorescence assay (IFA),ELISA、Alphalisa等技术,也同样适合检测BTK和pBTK水平,此类实验得益于优质的抗体。对于通量的筛选,也有的项目使用HiBiT内源敲入的细胞系,快速筛选可降解BTK蛋白的PROTAC分子,同时还可以看到降解的一些动力学过程,也可一并看到PROTAC分子对细胞增殖过程的影响。

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IFA assay(ICE数据)


PROTAC机制研究上可以通过ADME的方法、蛋白组学、结构生物学等手段,评价PROTAC分子在细胞内发挥作用的机制,也可以通过抑制剂的手段研究蛋白降解通路的特异性等等。针对更新的BTK突变,如C481S,T474S,T474M, T474M/E513G等突变的构建工作仍在进行中,还有很多工作需要进行。

做蛋白降解,自然会想到HiBiT-KI的系统,ICE也在积极布局该技术平台,也在积极拓展新靶点、新领域。在基因编辑水平,我们也在为特定的靶点项目准备对应的细胞系,包括过表达、敲入、敲除、突变引入、诱导表达或敲低系统等等,用于后续不同阶段的药物筛选和评价。

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PROTAC具有分子量较大、氢键较多、溶解性较差、透膜性较差、稳定性较差等特性,需要尽早收集ADME相关数据,比如PROTAC分子在溶液中的溶解度、LogD,LogP,在血浆、肠液、胃液、原代肝细胞、筛选细胞实验培养基中的稳定性等等,透膜性也是另一个重要的参数,比如测试Caco-2,MDCKII, MDCKII-MDR1等细胞系中的Papp,做细胞实验所需细胞系中的透膜能力等等;还有代谢稳定性,在肝微粒体和原代肝细胞中的稳定性等等。结合体外的筛选平台,也可以通过靶点结合和生物标记物分子的检测,快速评价PROTAC透过肿瘤细胞的能力及与靶点的结合能力。对于脱靶效应的检测,也是非常重要,这个也受限于PROTAC的基本原理,当分子与非靶点蛋白有较弱或中等的亲和力时,也有可能带来脱靶降解,常会用到蛋白组学的方法来分析。

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靶向药物早期筛选阶段经常使用酶学和细胞学的方法进行评价,便于快速得到化合物与靶点的相互作用及有效活性,经常也会遇见两种方法活性数据不一致的情况。对于PROTAC分子的透膜作用,还有一个简单便捷的实验,便于解释酶学和细胞学间活性差异。这个时候需要考虑一系列因素,毕竟酶学体系相对简单,只有蛋白、底物或一些盐离子成分,而细胞学体系增加了培养基(含有血清、丰富的蛋白组份)、细胞膜以及细胞中诸多的蛋白和酶类,分子若想与特异的靶点结合,还需要跨过一些屏障。也有文章报道了如何快速优化PROTAC分子的溶解度问题6

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Designing Soluble PROTACs6


液质联用(LC-MS/MS)可以快速结合细胞学化合物处理的条件,简单便捷分析一些参数,比如细胞对化合物的摄取量、非特异结合的量、生物转化的量、化合物溶解性及稳定性等等,这些分析简单的构成了细胞生物利用度,可以从一定程度上解释化合物在酶学和细胞学实验体系中活性的相对差异。爱思益普目前已经可以提供此类试验分析,可及时便捷地为大家提供troubleshooting的试验数据。

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纵观PROTAC领域的发展,这里仍需要坚持,需要探索,需要继续挖掘蛋白降解领域的一些更细致、更特异的机制。目前的靶点还是围绕已知靶点与难成药靶点,且大部分分布在细胞质与细胞核内。细胞膜上的受体和蛋白,是否有机会被靶向,并诱导降解?目前多种方式齐出手,希望在此片新型领域中有所突破。

但,做药和做科研是完全不同的两码事,出发点不同,目的不同,大家的投入和专注度自然也会不同。只以发文章为导向的科研,不会解决太多问题,在新领域的突破,需要一批人,持续而专注,经得起挫折,经得起失败。

中国之创新,未来是在企业?还是在基础科研?如何处理好“产、学、研”之间的相互关系,或许会给创新带来新的突破,我们拭目以待。

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The comparison of PROTAC targets on different diseases between 2001–2019 and 2001–2021.1

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目前一些研发团队也在尝试不同的技术手段,摸索新的蛋白降解方式,如分子胶,LYTACs,AUTACs,ATTECs,RIBOTACs,PhosTACs,以及Degrader-antibodyconjugates7等等,对于膜蛋白而言,ICE有着丰富的稳转细胞系储备,如离子通道、GPCR受体等,希望在膜蛋白的降解领域能给大家更多的支持。目前围绕PROTAC展开研发的靶点非常多,如此众多的靶点,很多药物都缺少成药性方面的评价。如何解决这个问题,让更多的PROTAC分子走进临床,将是我们下一步需要集中攻克的方向。

脚踏实地,携手并进!

希望ICE能过为中国蛋白降解领域的研发项目做一些事!

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Reference

1 He, M. et al. PROTACs: great opportunities for academia and industry (an update from 2020 to 2021). Signal Transduction and Targeted Therapy 7, doi:10.1038/s41392-022-00999-9 (2022).

2 Sun, X. et al. PROTACs: great opportunities for academia and industry. Signal Transduct Target Ther 4, 64, doi:10.1038/s41392-019-0101-6 (2019).

3 Bekes, M., Langley, D. R. & Crews, C. M. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat Rev Drug Discov, doi:10.1038/s41573-021-00371-6 (2022).

4 Alabi, S. B. & Crews, C. M. Major advances in targeted protein degradation: PROTACs, LYTACs, and MADTACs. J Biol Chem 296, 100647, doi:10.1016/j.jbc.2021.100647 (2021).

5 Daniels, D. L., Riching, K. M. & Urh, M. Monitoring and deciphering protein degradation pathways inside cells. Drug Discov Today Technol 31, 61-68, doi:10.1016/j.ddtec.2018.12.001 (2019).

6 Garcia Jimenez, D. et al. Designing Soluble PROTACs: Strategies and Preliminary Guidelines. J Med Chem, doi:10.1021/acs.jmedchem.2c00201 (2022).

7 Dragovich, P. S. Degrader-antibody conjugates. Chem Soc Rev, doi:10.1039/d2cs00141a (2022).



附录一:饶教授综述中提到的部分靶1

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在靶点的覆盖度上,ICE一直追求广而深,希望能在不同领域中支持到中国药物的研发进程,下图可见ICE在激酶靶点领域的布局,我们致力于补齐所有激酶相关的活性评价。图片.png

ICE激酶谱平台

附录二:PROTAC-DB (PROTAC-DB (zju.edu.cn))

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