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《爱求索》之靶点探索篇——BTK突变产生耐药及应对策略研究进展

时间:2022-09-30 16:33:11 阅读:24


布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton′s tyrosine kinase,BTK)隶属于非受体酪氨酸激酶Tec家族,为膜结合蛋白, 表达于除 T、NK 和浆细胞外的所有造血谱系细胞。BTK作为B淋巴细胞受体通路的重要信号分子,在B细胞发育各个阶段均表达。研究表明,BTK参与调控B淋巴细胞的发育、分化、活化、增殖及凋亡等过程。BTK抑制剂在多种淋巴瘤及白血病中发挥良好疗效,但随着临床的广泛应用及病人用药时间的延长,患者出现耐药。研究发现BTK突变是产生耐药的主要机制。进一步研究显示,非共价抑制剂、多靶点治疗、联合用药、 蛋白降解等策略为克服耐药问题提供了新思路。本文将详细阐述BTK抑制剂耐药机制以及应对策略。



BTK结构及作用
1.1 BTK结构

BTK结构域类似Src激酶家族,包括SH1(Src homology 1)、SH2(Src homology 2)、 SH3(Src homology 3) 、PH(pleckstrin homology)和TH(TEC homology )结构域[1]不同的结构域发挥不同的功能,其中PH结构域能与多种蛋白结合、参与信号转导;SH3结构域能特异性地与富含脯氨酸的TH结构域结合,从而诱发分子内折叠;SH2结构域能识别磷酸化酪氨酸;SH1结构域高度保守,含有1个磷酸化位点Tyr551和Cys481共价结合关键点,Cys481与BTK活化有关[1]。下图1.1为BTK X射线晶体结构。

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图1.1BTK的蛋白质结构

1.2 BTK信号通路
BTK 在多种信号途径中发挥关键作用,不仅参与 Fcγ 受体 (FcR) 信号级联,也是 B 细胞受体 (BCR) 信号通路的重要组成部分,调节 B 细胞的存活、活化、增殖、成熟和凋亡[1]B 细胞表面的 BCR 在被 Syk 等上游激酶激活后, BTK 启动下游 Src 家族激酶的信号级联反应,例如 Lyn 和 Fyn,以及抗体生成。Lyn能使CD19中的酪氨酸残基磷酸化,从而激活P13K(phosphatidylinositol 3-kinase), P13K能将磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2)磷酸化为PIP3,之后PIP3结合到BTK的PH结构域,募集BTK到细胞膜上,随后Lyn和Syk磷酸化BTK Tyr551,进而导致BTK  Tyr223自磷酸化,从而BTK活化完成[2]
BTK活化后会使下游底物PLCγ2蛋白磷酸化,调节B细胞内的钙离子水平,间接激活下游通路。这些促进了 NF-κB 和 NFAT 依赖途径的激活以及参与B细胞增殖和存活基因的表达。当人体的BTK因发生缺陷时,会导致未成熟的B细胞发育停滞而无法产生正常的免疫应答,最终导致无丙种球蛋白血症;BCR通路的异常激活可见于多种B细胞恶性肿瘤,主要包括慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia,CLL),小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocyticlymphoma,SLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse largeB‐cell lymphoma,DLBCL),套细胞淋巴瘤(mantle celllymphoma,MCL)和华氏巨球蛋白血症(Walmacroglobulinemia,WM)等[2]。目前,BTK是研究临床治疗B细胞类肿瘤及B细胞类免疫疾病的研究热点。下图1.2为WHO列举的淋巴细胞瘤各类型所占比例[3]

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图1.2淋巴细胞瘤分类及比例


BTK抑制剂


近年来,许多小分子BTK抑制剂已相继报道,根据与BTK催化结构域结合模式的不同可以分成两类:一类BTK 抑制剂是与 BTK 的 ATP 结合位点中的氨基酸残基 Cys481 形成共价键的不可逆抑制剂,另一种类型的 BTK 抑制剂可进入BTK的特定SH3口袋,与激酶的非活性构象结合的可逆抑制剂。BTK抑制剂可下调BCR通路,进而抑制恶性B细胞的增殖,在临床上已作为恶性B细胞淋巴瘤的靶向药物,BTK抑制剂现已成为治疗相关疾病的热门靶点[4]

目前已有多个不可逆BTK获准上市,如依鲁替尼(ibrutinib)、阿卡拉布替尼(acalabrutinib)、泽布替尼(zanubrutinib)、替拉鲁替尼(tirabrutinib)等[3]。其中依鲁替尼是首个被批准用于临床的第一代不可逆小分子BTK抑制剂,已经广泛用于多种淋巴瘤。依鲁替尼以4-氨基吡唑并嘧啶为特征骨架,加入α,β-不饱和醛形成丙烯酰胺亲电基团,与BTK的ATP催化中心的Cys481共价结合,从而不可逆的抑制BTK的活性,中断B细胞信号传导通路,最终致使B细胞死亡。另外,其能抑制Try223处的自磷酸化阻遏BTK的完全活化[5]虽然依鲁替尼能显著的抑制BTK,但同样抑制Tec家族的其他激酶,因此会导致出血、腹泻、中性粒细胞减少、皮疹等多种不良反应。

BTK可逆抑制剂CGI-1746对BTK以外的受体无活性,其中心芳基和四氢苯并噻吩的酰胺在亲脂性口袋中进行相互作用,诱发Tyr551产生Src-like的失活构象变换,进而抑制BTK的活性。其不与Cys-481结合,活性较高,但该结构中的酰胺键在体内容易羟基化,代谢失活,严重影响成药性[6]




BTK抑制剂耐药机制


BTK突变是产生耐药的主要机制,突变后的BTK影响抑制剂的共价结合,导致耐药。研究发现,部分对依鲁替尼耐药的患者,其BTK 481位半胱氨酸残基突变为丝氨酸 [7]严重降低了依鲁替尼和BTK的亲和性,是产生耐药的主要原因。BTK Cys481除了突变为丝氨酸外,还会突变为苏氨酸、精氨酸、络氨酸、苯丙氨酸等[8]。另外,BTK 474位的苏氨酸(Thr474)突变为丝氨酸/异亮氨酸,使蛋白口袋区减小,与小分子抑制剂亲和力下降;BTK SH2结构域中的316位苏氨酸(Thr316)突变为丙氨酸(Ala 316),其能阻止与磷酸络氨酸的接触,进而降低BTK与其配对蛋白的亲和力,产生耐药[9]。除BTK突变以外, PCLγ2蛋白突变、8号染色体的缺失及Igβ(CD97b)的过表达都会导致耐药的产生。



针对BTK抑制剂耐药的应对策略
从根本上解决BTK突变所致耐药的问题,可以采取以下方式进行改善:①与未活化的BTK结合且不与Cys481共价结合的非共价抑制剂。②联合用药或多靶点策略;③利用PROTACs策略靶向降解突变BTK。

4.1 BTK可逆抑制剂
目前,有研究报道选用非共价结合BTK 抑制剂对耐药细胞株效果明显。Genentech 公司研发的BTK 抑制剂Fenebrutinib(GDC‐0853)能够不依赖于C481位点与BTK可逆性结合,因此不受突变影响。Fenebrutinib通过抑制B细胞的活化,阻断BTK下游信号通路,进而抑制B细胞增殖。与依鲁替尼相比,其对EGFR(epithelialgrowth factor receptor)和ITK(IL‐2 inducible T‐cell kinase)没有抑制作用,因此副作用更小。临床研究发现该药对 C481S 突变的 B 细胞非霍奇金淋巴瘤有效[10]

4.2联合用药

基因突变导致的耐药对小分子药物形成了巨大的困扰, 单一的BTK抑制剂无法持续发挥作用时,与其他靶向药物联合使用,能增强药物对肿瘤细胞的靶向性及杀伤作用,显示出药物的协同作用。有研究发现,在CLL细胞上联合使用BTK抑制剂与维奈克拉,增强了维奈克拉对肿瘤细胞的有效性[11]


4.3降低BTK蛋白含量

有研究发现使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂Abexinostat可以提高B细胞淋巴瘤细胞中以BTK为靶点的miRNA含量,下调BTK表达,且对BTK C481S突变的细胞同样有效[11]。有研究发现将伊布替尼、PROTAC(proteolysis‐targeting chimeras)与泊马度胺组合,能明显增强C481S突变BTK经泛素-蛋白酶体途径的降解,从而抑制BTK C481S突变细胞的增殖。

为此,爱思益普团队准备了多种BTK降解的相关平台,比如常规Western blot,数字化western blot,Jess,还有高内涵的免疫荧光IFA实验,均可以很好的看到蛋白的线性相关性及降解趋势。


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BTK降解评价方法(ICE数据)

此外,爱思益普还通过慢病毒转染构建了多种BTK突变稳转细胞系,如HEK293-BTK-C481A、C481F、C481R、C481Y、T316A、T474S、T474M及T474M/E513G。还有Knock-in细胞包括Ramos-BTK– HiBiT KI及Ramos-BTK-C481S KI也正在构建过程中。爱思益普细胞编辑团队可以为客户提供需要的细胞系,下图1.3为不同BTK过表达细胞系单克隆IFA图,目前突变体稳转细胞系的降解实验以及BTK磷酸化的实验都有一些优化的数据,可随时垂询,结果未在此展示。

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图1.3 单克隆细胞系BTK 蛋白表达量高(IFA)

爱思益普团队目前仍在继续拓展细胞系构建和编辑平台,两个月左右的时间拿到八株验证的稳转细胞系,我们也在挑战自己的效率。公司细胞种类贮备充足,设备先进,团队在实验中积累了大量研发经验,为后期新型降解药物的研发奠定了坚实的基础。

关注未来难成药,益普创新脱靶点。探索之路还很漫长,我们会继续努力,加油!



参考文献

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[6] WOYACH J A,BLACHLY J S,ROGERS K A,et al.Acalabrutinib plus Obinutuzumab in Treatment ‐ Naive and Relapsed / Refractory Chronic Lymphocytic Leukemia[J]. Cancer Discov,2020,10(3):394‐405.

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[10]BYRD J C,SMITH S,WAGNER‐JOHNSTON N,et al. First‐in‐hu‐ man phase 1 study of the BTK inhibitor GDC‐0853 in relapsed or refractory B‐cell NHL and CLL[J]. Oncotarget,2018,9(16):13023‐13035.

[11]DENG J,ISIK E,FERNANDES S M,et al. Bruton′s tyrosine kinase inhibition increases BCL‐2 dependence and enhances sensitivity to venetoclax in chronic lymphocytic leukemia[J].Leukemia,2017,31(10):2075‐2084




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