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KRAS是肿瘤中常见的突变癌基因之一，在胰腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌中突变率分别超过90%、40%和30%。然而，KRAS因其蛋白表面缺乏适合小分子药物结合的深口袋，曾长期被视为"不可成药"靶点。直到2013年KRAS G12C突变体共价抑制剂概念的提出，以及2021年sotorasib的获批上市，这一领域才真正打开了靶向治疗的大门。
KRAS的结构特点与成药化突破
KRAS蛋白属于小GTP酶家族，在GTP结合的活性状态和GDP结合的非活性状态之间循环。野生型KRAS与GDP/GTP的结合亲和力极高（皮摩尔级别），传统小分子难以通过竞争性机制有效干预。然而，KRAS G12C突变在Switch II区域引入了一个半胱氨酸残基，为共价抑制剂提供了独特的结合位点。共价抑制剂通过与C12形成共价键，将KRAS锁定在非活性的GDP结合状态，从而阻断其下游信号传导。
目前已获批的KRAS G12C抑制剂（sotorasib和adagrasib）均采用这一机制，在KRAS G12C突变的非小细胞肺癌中显示出显著疗效。然而，单药治疗面临原发性和获得性耐药问题，耐药机制包括KRAS本身的二次突变（如Y96D、R68S）、旁路通路激活（如RTK-RAS-MAPK通路再激活）和上游信号增强。因此，KRAS抑制剂的联合用药策略（如联合SHP2抑制剂、EGFR抑制剂或免疫检查点抑制剂）成为当前研发的重要方向。
KRAS抑制剂筛选的多层级评价体系
KRAS抑制剂的筛选需要在多个层面进行验证。在生化层面，可通过核苷酸交换实验（Nucleotide Exchange Assay）检测化合物对KRAS-GTP/GDP交换速率的抑制效果；通过表面等离子体共振（SPR）或差示扫描荧光法（DSF）评价化合物与KRAS蛋白的结合亲和力。对于G12C抑制剂，还可利用质谱技术检测化合物与C12的共价结合情况。
在细胞层面，KRAS G12C突变的肿瘤细胞系（如H358、MIA PaCa-2）是评价化合物活性的常用模型。通过检测p-ERK、p-MEK等下游信号分子的磷酸化水平，以及细胞增殖抑制率（IC50），可以初步判断化合物的细胞效力。此外，对于联合用药研究，需要评价药物组合的协同效应，常用方法包括Chou-Talalay联合指数分析和等效线图解法。在成药性评价方面，KRAS抑制剂的口服生物利用度和代谢稳定性是关键参数，需要通过DMPK研究进行系统评估。
KRAS领域的新靶点拓展
除了KRAS G12C，针对其他KRAS突变体（如G12D、G12V、G12D）的药物研发也在加速推进。非共价抑制剂策略通过识别KRAS的变构口袋或天然核苷酸口袋，有望覆盖更广泛的突变类型。此外，上游调控因子（如SOS1、SHP2）和下游效应通路（如MEK、ERK）的抑制剂，与KRAS抑制剂联合使用可能产生协同抗肿瘤效应。SOS1抑制剂通过阻断KRAS的鸟苷酸交换因子（GEF）活性，抑制KRAS从GDP状态向GTP状态的转化，这一机制不受KRAS突变类型的限制，因此具有更广泛的适用性。
在国内，部分CRO机构已建立了KRAS靶点的完整筛选平台，涵盖生化检测、细胞活性评价、耐药机制研究和DMPK分析等能力，为KRAS抑制剂的药物研发提供全链条支持。随着KRAS靶向治疗进入临床应用的快速通道，高质量的筛选平台对于加速新药发现具有关键意义。
