在典型的三元复合物体系中,PROTAC 或类似分子桥接靶蛋白(如激酶)与 E3 泛素连接酶,使两个带标签的蛋白相互靠近:一个蛋白融合 NanoLuc 荧光素酶,另一个融合 HaloTag。当第三个分子促进复合物形成时,NanoLuc 供体与荧光 HaloTag 配体靠近,产生可测量的 BRET 信号。
同一原理也适用于分子胶(促进或稳定原本不易发生的蛋白相互作用)与 RIPTAC(通过诱导邻近把靶蛋白重定向至另一蛋白)。三元复合物形成越多,BRET 信号越强;复合物被破坏则信号下降。信号强度与浓度-反应行为可用于表征诱导邻近复合物形成的效率、效力与动力学。
在 MG-132 存在时靶蛋白降解被抑制,PROTAC 可能表现为更有效地稳定三元复合物,表观 EC50 更低。该读数帮助把「复合物形成」与「后续靶蛋白降解」两个环节区分开,支持对诱导邻近化合物更完整的评价。
评价 PROTAC 促进靶蛋白-E3 连接酶三元复合物形成的能力,在下游降解研究之前完成诱导邻近表征。
研究分子胶如何诱导或稳定蛋白间相互作用,比较化合物系列的浓度依赖三元复合物形成。
评估靶蛋白与被招募效应蛋白之间的诱导邻近,在活细胞中刻画 RIPTAC 驱动的三元复合物形成。
兼容 96/384 孔板,适合 PROTAC、分子胶、RIPTAC 等诱导邻近调节剂的筛选。
TCFA 位于「靶点结合(TE)」之后、「降解与功能评价」之前:先确证三元复合物能否形成、形成的效率与效力如何,再进入降解率、DC50 等下游研究,可避免把复合物形成不足误判为降解机制问题。
可以。联合 MG-132 等蛋白酶体抑制条件,降解被阻断时仍可读出的信号即反映复合物形成本身;表观 EC50 的变化帮助区分两个环节。
可以。凡是依赖诱导邻近的三组分体系(靶蛋白-分子胶-效应蛋白、靶蛋白-RIPTAC-招募蛋白)都适用 NanoLuc-HaloTag 的 BRET 读出。
支持。浓度-信号曲线可比较系列化合物的复合物形成效率与效力;96/384 孔板型支持从中等到高通量的筛选。