降解定量方法学：从 WB 到 HiBiT 的 DC50 读法

做 PROTAC 的人都会遇到同一个坎：怎么证明靶蛋白真的被降解了？ 这个问题听起来简单，做起来却处处是坑。传统 Western Blot（WB）虽然经典，但通量低、定量粗糙、误差大；更要命的是，PROTAC 的效果不是"有或没有"，而是"在什么剂量下、降解到什么程度"——也就是那个决定分子成败的 DC50（降解一半所需的浓度）。要读准这个数，靠的不只是一张条带图，而是一整套方法学。

先说经典的 WB。它的价值是"看得见"：把细胞裂解、跑胶、转膜、抗体孵育，终在条带上直观看到靶蛋白是否随剂量下降。对于方法优化的早期阶段，WB 是建立"这分子到底降不降解"认知的步。但它的局限也很明显——半定量、流程长、难以高通量，想用它精确拟合 DC50、横向比较几十上百个分子，力不从心。

于是有了数字化 WB（JESS）。JESS 把传统 WB 的跑胶、转膜、杂交、显影整合进一根毛细管里自动完成，样本制备简单、定量精准、可重复性高。它既能给出传统 WB 那样的"虚拟泳道图"，又能输出可直接用于 DC50 拟合的定量曲线。以爱思益普的实际数据为例，针对 BTK-PROTAC 的降解评价，JESS 给出了清晰的剂量依赖降解，拟合出的 DC50 为 1.175 nM——这个量级的信息，对判断分子活性、指导后续结构改造，价值远高于一张"浓淡不一的条带"。

再进一步，是面向高通量的细胞微孔板法。ICW（In-Cell Western）用近红外荧光抗体直接在微孔板里做"细胞内的 WB"，把降解检测塞进 96/384 孔板，兼顾通量与定量。爱思益普用 ICW 对 P300、CBP、H3K27Ac 三个靶点做降解定量，分别得到 0.75、1.51、4.18 nM 的 DC50，一次实验就能把一个分子对多个靶点的选择性一起看清。IFA（免疫荧光分析）+ 高内涵成像则更进一步，在单细胞水平定量靶蛋白，方法线性优异（R² 达到 0.9987），BTK 降解的 DC50 为 9.28 nM，还能输出"浓度梯度下荧光信号逐步恢复"的成像证据。

高效的一档，是 HiBiT 内源敲入稳转细胞系。HiBiT 技术把一段只有 11 个氨基酸的小标签敲入内源靶基因，再搭配互补的大亚基 LgBiT，靶蛋白一出现就能发出可测荧光——于是"蛋白还剩多少"变成了一道实时、高通量、无需抗体的光学读数。爱思益普已建成多个 HiBiT 敲入细胞系（如 BRD4、cMYC、IKZF1、STAT3、SMARCA2），可以快速筛选可降解靶蛋白的 PROTAC，同时观察降解动力学与分子对细胞增殖的影响。

把这些方法串起来，才能拼出完整的"降解画像"：WB 定性起步，JESS/ICW/IFA 精确定量 DC50，HiBiT 上通量与动力学。对 TPD 研发来说，选对方法学，等于给"降解"这个核心事件装上了一把准的尺子。