PROTAC 降解检测方法学：从传统 Western Blot 到数字化定量

PROTAC 药物的评价，和传统小分子有一个根本区别：传统抑制剂看的是"抑制了多少活性"，而 PROTAC 看的是"降解了多少蛋白"。这个区别，决定了 PROTAC 的检测方法学必须围绕"蛋白水平"来展开。爱思益普的靶向蛋白降解平台，正是用从传统 Western Blot 到数字化定量的一整套方法，来准确读出蛋白的降解程度。

传统 Western Blot（WB）是蛋白降解检测的起点。它直观、经典，能清楚看到靶蛋白条带随剂量升高而逐渐变浅的趋势。爱思益普团队在方法优化的早期，会先利用传统 WB 观察靶蛋白降解趋势，为后续的数字化定量与高通量筛选建立方法基础。WB 的价值在于"看得见的趋势"，但它也有局限——步骤繁琐、定量精度有限、通量低。

数字化 Western Blot（JESS）则补上了定量的短板。相比传统电泳 WB，JESS 制备样本流程简单、定量便捷，能准确确定蛋白降解情况并用于后续筛选。爱思益普团队已用 JESS 顺利完成多项蛋白降解相关实验，例如对 BTK 蛋白的剂量依赖性降解进行定量，得到精确的 DC50 数值。JESS 把 WB 从"半定量看趋势"推进到了"精准定量出数值"。

ICW（In-Cell Western）进一步提升了通量。它适合微孔板方式的通量化细胞活性筛选，能在细胞层面同时对大量 PROTAC 分子进行降解评价，兼顾通量与定量准确性。例如爱思益普已用 ICW 完成了 P300、CBP、H3K27Ac 等多个靶点的降解定量，得到各自的 DC50 数值，为大规模分子筛选提供了效率支撑。

IFA（免疫荧光检测）则把定量推进到了单细胞水平。它基于高内涵成像，在单细胞水平定量靶蛋白降解，方法线性优异。爱思益普用 IFA 完成了 BTK 降解的定量，并展示了从高浓度到低浓度的荧光信号梯度恢复。单细胞水平的数据，能揭示细胞群体内部的异质性，这是群体平均读数难以捕捉的信息。

HiBiT 内源敲入细胞系，是另一条高效路线。利用 HiBiT 内源敲入的细胞系进行通量筛选，可以快速筛选出能降解目标蛋白的 PROTAC 分子，同时观察降解动力学过程及其对细胞增殖的影响。爱思益普已建立多个 HiBiT 敲入细胞系（覆盖 BRD4、cMYC、IKZF1、STAT3、SMARCA2 等靶点），用于 PROTAC 降解评价。

这些方法并不是彼此替代，而是构成了一个层层递进的检测体系：WB 看趋势、JESS 精确定量、ICW 提通量、IFA 看单细胞、HiBiT 看动力学。爱思益普在蛋白水平结合这些方法，配合 AlphaLISA、ELISA、HTRF 等手段，为不同的研发阶段提供匹配的降解读出方案。

对研发者来说，理解 PROTAC 检测方法学，是正确解读降解数据的前提。同样是"蛋白降解了"，用 WB 看的趋势和用 JESS 定的 DC50，含义并不相同；群体平均的定量和单细胞水平的定量，回答的问题也不同。方法选对，PROTAC 的降解评价才能真正指导分子优化。

还需要留意的是，PROTAC 的评价不止"降解量"这一个维度。降解的动力学——蛋白下降有多快、能降到多低、撤药后多久恢复——同样重要；降解的选择性——是否误伤了同源蛋白——也是必须回答的问题。HiBiT 敲入细胞系之所以有价值，就在于它能在高通量下同时观察降解动力学与对细胞增殖的影响，把评价从"静态的降解了多少"推进到"动态的降解过程如何"。

从 WB 到 JESS，从 ICW 到 IFA，再到 HiBiT，检测方法越来越精细，回答的问题也越来越具体。这背后反映的，是 PROTAC 研发从"验证能不能降解"走向"精确刻画降解行为"的整体演进。一个成熟的靶向蛋白降解平台，正是要用这一整套方法，为研发者提供完整、可信的降解画像。

PROTAC 的核心问题是"降解了多少、降解得怎么样"，而方法学的核心任务，就是把这个看似简单的问题，变成一个可以量化、可以比较、可以指导决策的明确答案。